Этикетка

Том 12 научных докладов, номер статьи: 12746 (2022 г.) Цитировать эту статью

1099 доступов

Подробности о метриках

Полная голографическая характеристика (THC) представлена ​​здесь как эффективный, автоматизированный, не требующий меток метод точного определения жизнеспособности клеток. THC — это технология определения характеристик отдельных частиц, которая определяет размер и показатель преломления отдельных частиц с использованием теории рассеяния света Лоренца-Ми. Хотя оценка жизнеспособности клеток является проблемой во многих приложениях, включая производство биологических препаратов, традиционные подходы часто включают ненадежное мечение красителями и/или трудоемкие методы ручного подсчета клеток. В этой работе мы измерили жизнеспособность дрожжей Saccharomyces cerevisiae в присутствии различных концентраций изопропанола в зависимости от времени. Все измерения ТГК проводились в естественной среде образца без разбавления или добавления меток. Голографические измерения проводились с помощью линейного голографического микроскопа с использованием объектива 40×(×) с плосковолновым освещением. Мы сравнили наши результаты с ТГК с ручным подсчетом живых и мертвых клеток с использованием красителя трипанового синего. Наши результаты показывают, что ТГК может эффективно различать живые и мертвые дрожжевые клетки по показателю преломления отдельных клеток.

Дрожжевые клетки, особенно Saccharomyces cerevisiae, широко используются как в промышленности, так и в научных кругах1,2,3 для различных применений — от клеточных экспериментов до производства белков. Например, в медицинских исследованиях дрожжи служат модельным организмом для изучения генетических мутаций, связанных с раком4,5,6. В биофармацевтических исследованиях и производстве дрожжевые клетки используются в качестве мини-фабрик по производству интересующих белков7,8,9. Кроме того, в одном из наиболее известных применений дрожжи используются в исследованиях и производстве потребительских товаров для оптимизации производства пива, вина и хлеба10,11,12,13.

Жизнеспособность клеток является ключевым параметром, представляющим интерес во многих из этих приложений14. Хотя существуют многочисленные методы измерения жизнеспособности дрожжей, большинство из них имеют одно ограничение: необходимость окрашивания клеток красителем. Методы на основе красителей, такие как анализ исключения трипанового синего (ТБ), основаны на том, что мембраны здоровых клеток непроницаемы для красителя, в то время как мембраны мертвых или поврежденных клеток позволяют красителю диффундировать в клетку15. Хотя этот метод полезен, он обычно требует утомительной подготовки проб и ручного подсчета клеток. Ручной подсчет клеток страдает от низкой статистики и подвержен человеческим ошибкам. Кроме того, было показано, что анализ исключения туберкулеза переоценивает жизнеспособность и ненадежен для некоторых образцов клеток с жизнеспособностью менее 70–80%16,17,18.

Кроме того, при любых измерениях жизнеспособности окрашивания на основе красителя существует опасность того, что краситель может непредвиденным образом взаимодействовать либо с клетками, либо с другой экспериментальной переменной. Например, было показано, что трипановый синий отрицательно взаимодействует с клетками, часто разрушая их и, таким образом, делая измерения жизнеспособности ненадежными19. Хотя недостатки анализов жизнеспособности на основе меток хорошо известны, существует мало альтернатив без меток20.

В этой работе мы представляем автоматизированный метод, не требующий этикеток, для надежного измерения жизнеспособности дрожжей с использованием Total Holographic Chartatureization® (THC). ТГК — это технология, основанная на голографической видеомикроскопии, разработанная для обнаружения, подсчета и определения характеристик невидимых частиц в суспензии21. Здесь мы оценили жизнеспособность дрожжей с помощью xSight, который реализует THC и сочетает голографическую микроскопию с микрофлюидной обработкой образцов для обеспечения точных измерений размера частиц и показателя преломления. Использование одноразовых микрофлюидных чипов для образцов гарантирует отсутствие перекрестного загрязнения между образцами и отсутствие необходимости очистки. Каждое измерение автоматизировано и занимает около 15 минут.